流式细胞仪检测的原理

流式细胞仪检测的原理
流式细胞仪检测的原理

流式细胞仪检测的原理
很简单的啊.
流式细胞仪数据分析
5.1 数据采集及显示
光信号转换成电压脉冲后,再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号. 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储,该标准由“分析细胞学协会”制定.
根据FSC标准,数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件,数据设置文件和数据分析结果. 4参数（FSC,SSC,FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据.当单个样品累计收集到10000个细胞时,FCS数据文件为80kB.
数据采集存储完毕后,细胞亚群可以几种不同格式显示.单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图,横轴表示荧光通道.纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）.处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值,而且具有相同的信号密度.通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧,越靠右侧荧光亮度越强. 图5-1 流式数据分析图
双参数可在二维散点图中同时显示,X轴显示通道1（FL1）,Y轴显示通道2（FL2）.3维图通过X,Y,Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）.

习题：数据采集及显示
1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 .
2 二维点图用于显示 参数.
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 .
5.2 设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域.如：血样本是混合细胞群,如果想单独分析淋巴球细胞,可根据FSC或细胞大小,在FSC,SSC的散点图中设门,其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性. 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

习题：设门
1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞.（对 错）
5.3 细胞亚群的数据分析
数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况.如前所述,分别有几种形式的点图用于显示数据,而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群. 如图5-3所示,在淋巴细胞亚群周围设门,以单独分析或分选该亚群细胞.

图5-3 选定淋巴细胞亚群设门
门内细胞的数据结果可在随后的图中显示.在下面的实例中,我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法. 我们可以通过单参数直方图,二维点图和三维图来分析结果.单参数直方图可定位边界,二维点图可设置象限标志.如果需要,还可以建立数据统计表以输出结果. 直方图可直观单个参数的细胞数量.阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）.左图中M1为阴性对照峰.右图中M2为CD3 FITC阳性峰.

图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明,整个事件共记录了6000个细胞,门内淋巴细胞2891个.其中M1（阴性）细胞619个,M2（CD3阳性）细胞2272个细胞.淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%.

图5-5 直方图统计结果
二维点图以双参数显示结果,每个点表示一个或多个细胞.图5-6为阴性对照图,用于设定阴性对照边界,全图划分为四个象限,以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞.左下象限（LL）为双阴性细胞,左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE）,左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC）,右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）.

图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示,淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%.

图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域,也就是设门.我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量.在图5-9中,R4门内为CD4阳性,CD3阴性的淋巴细胞亚群,其结果为：40/2866=1.40%.

图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果
这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷,因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界,在随后的文件中,下一个样本的细胞亚群位置会发生变化,这就需要操作者重新调整区域或边界位置. 为避免这种情况的发生,我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法.BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件.该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动,自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）.

图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比
5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析
这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量,对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用.因为单克隆细胞株是单个细胞群,在大多数情况下,既不是100%阴性,也不是100%阳性,所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率.如果样本的统计结果远远大于阴性对照组,那么我们认为其结果是阳性的,两者间的差异越大,说明细胞的表达越高,阳性率越高. 如图5-11所示,左图为单细胞群的散射光信号,右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图.每个峰的几何均值分别为2,5和20（从左至右）.

图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率,几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析.

QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数.如图5-12所示,Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息,用于计算每个细胞的接合点位数. 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析.因为DNA峰（G0/G1期,S期和G2M期）不是离散的,所以我们对曲线以下的面积进行积分,以得到每个细胞亚群的百分含量结果.

图5-13 细胞周期的DNA直方图
习题：数据分析
1二维点图和一维直方图的作用分别是什么?
2 见图5-4和图5-5,CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少.
3 LL象限代表双阳性细胞亚群.（对 错）
4 见图5-6和图5-7,淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少.
5 只能使用矩形设定细胞区域范围.（对 错）
6 使用区域设定法分析样本有哪些不足.
7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么.
8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率.
5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用
CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件.它运行于苹果电脑上,优质的矢量图显示使得操作界面特别优美.现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的,可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感.CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上.
1．软件数据流程
在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包.方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系.可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据.每个采集方案分析样本后会生成数据包,该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值,格式为FCS2.0或FCS3.0.



数据包必须由方案文件打开,无法单独显示,或者可由第三方软件进行分析,如WinMDI.
2.软件与仪器的连接

流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息,所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪,然后再开启计算机.
1、\x09先开仪器后开计算机,以确保仪器和计算机之间的正常通讯.
2、\x09在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件.
3、\x09从Aquire菜单下选择connet to cytometer.
3．方案与数据之间的关系
CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存,数据包可以由任一方案文件进行分析,分析后不改变数据包中的任何数据.CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire,Analysis和Acquire-Analysis.
当图的属性为Acquire时,此图只限于采集下用,即只当进行检测时它才能显示颗粒；
当图的属性为Analysis时,此图只限于分析已保存的数据包,它不能用于采集数据.
当图的属性为Acquire-Analysis时,此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据.
所以方便起见,我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性.

CellQuest Pro CellQuest
4．方案的建立
A选择实验参数
默认情况下,FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器,及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3.当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项,仪器自动打开633nm激光器.

B,建立散点图或直方图,命名坐标

CellQuest Pro软件主要工作界面,软件类似于Office word的工作面,可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图.



在CellQuest软件下,需在选择Plot菜单,选择Format来打开图的属性对话框,其中包括了关于该图所有选项.
建立好直方图或散点图后,我们需要对所选的参数进行命名,如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4.

在菜单上选择Acquire栏目,选择Parameter Description,可出现关于文件存储和参数命名的对话框.在这个对话框中用P字母来代表每个参数,并在此对每个采集参数进行命名,FL1为CD3FITC,FL2为CD4PE…….
C,设门并建立门与图之间的关系


R与G的关系
R是Region的首个字母,Region一般是指一个闭合形的区域,如矩形区、自由区和圆形区.区域与区域之间可以进行逻辑运算,如AND、OR、NOT等关系.当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：
Gate实际了个代数式,简称G,其运算式默认如下：
G1 = R1,或G2=R2
当我们要进行逻辑运算时,可变更为G1=R1 AND R2.此时G1就成了一个算术结果了.
G1=R1 AND R2
G2=R1 NOT R2
G3=R1 OR R2


Region List管理门,可以重命名或删除门.Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具.
建立门与图之间的关系

打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框,选择Gate选项,选择门即可.
D,显示统计参数


5．仪器的操作
当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：

在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下,同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：


6．文件的保存及调用
实验或分析过程中所建的方案可以保存下来,通File下拉菜单可以保存这些方案文件：

如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性）,有两种方案打开以往的数据：
方法一：选择直方图或散点图,打开该图的属性框（Plot->>Format）,见下图：

在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包.
方法二：选中方案中所有的直方图或散点图,打开Plots菜单,选择Chang Data File,打开要分析的数据包.

附：CellQuest Pro软件所有下接菜单

1生物学颗粒分析原理
2流式细胞仪细胞分选原理